Оглавление

Форум

Библиотека

 

 

 

 

 

Лаборатория Б. Н. Вепринцева - (очень) нервной клетки

В главе "Пущино" рассказано о создании в начале 60-х годов нового научного центра АН СССР в Пущино . В Москве уже существовал и набирал силу Институт биофизики . Сотрудники института не имели никаких резонов бросать свои оборудованные лаборатории и весь сложившийся уклад жизни и ехать за 120 км от Москвы в Пущино, где среди разрытых котлованов начавшихся строек только угадывались основания новых зданий. Не было снабжения. Первый магазин и первую школу построили лишь в 1963 г.,

Вопреки правилам, не были до начала строительства построены дороги. В дождь нельзя было пройти по поселку без резиновых сапог. Весной 1963 г. при бурном таянье снегов Ока вышла из берегов и затопила идущую вдоль поймы древнюю дорогу. Пущино было почти на две недели отрезано от мира. Жителям вместо хлеба выдали муку. Первые лабораторные помещения расположили в здании будущего вивария. Зато был полный простор для реализации самых смелых планов. Переезд в Пущино означал фактически создание нового Института биофизики. Нужен был особый нервный склад, чтобы испытывать энтузиазм в новых условиях.

Борис был увлечен открывающимися перспективами. Для работы в Пущине под его руководством была организована Лаборатория Биофизики нервной клетки . Для исследования связи электрической активности клетки с ее метаболизмом, выяснения роли в этих процессах нуклеиновых кислот и белков, изучения природы рецепторов, реагирующих на специфические нейромедиаторы, необходимы клетки по возможности больших размеров. Такие клетки были обнаружены в ганглиях мозга голожаберных моллюсков Д. А. Сахаровым на Беломорской биостанции МГУ в 1961 г. Через год Сахаров вместе с Вепринцевым и И. В. Крастсом на о. Путятине нашли гигантские (почти 1 мм) нейроны в окологлоточном ганглии глубоководного голожаберного моллюска Тритонии . Можно было воткнуть в такие клетки несколько микроэлектродов и сопоставить их электрическую активность с "биохимией". Однако в Пущине нет ни кальмаров, ни голожаберных моллюсков. Проблема была решена: очень крупные нейроны оказались и у пресноводных брюхоногих моллюсков - наших обычных прудовиков и катушек. На этих объектах были выполнены классические работы, ставшие известными во всем мире. Я употребил слово "классические" вполне сознательно. Это работы в направлениях, заданных уровнем развития мировой науки. Проблема связи медиаторов и рецепторов, электрической активности и метаболизма, ионных градиентов и биопотенциалов все это классика. И занять здесь достойное место среди различных лабораторий мира очень сложно. Для этого нужны современные приборы, оригинальные методы, адекватные объекты. Нужны микроманипуляторы и инструменты для микрохирургии (клетки), усилители с высокоомным входом и аппараты для изготовления микроэлектродов. Это было время выяснения механизмов синтеза белка, взаимоотношений нуклеиновых кислот и белков, физиологической роли вновь синтезированных белков.

Появилось много ярких волнующих гипотез. Шведский биохимик Хиден предположил, что новая информация, возникающая при возбуждении нервов, кодируется посредством синтеза специфических молекул РНК. В продолжение этой гипотезы американский зоопсихолог Мак-Коннелл предположил, что информация зафиксированная в молекулах РНК может передаваться от организма к организму посредством таких молекул. Отсюда возникла серия работ на планариях и поэтическая картина - "неученные планарии" поедают ученных и получают их "знания" - выработанные у ученных рефлексы.

Вепринцев поставил в лаборатории более аккуратную задачу - исследование связи метаболизма РНК и возбуждения нервной клетки. Задача эта казалась сотрудникам очень сложной. Нужны были новые самые тонкие методы, радиоавтография, электронная микроскопия и т. п. В лаборатории была непростая обстановка (отсюда я прибавил к названию лаборатории слово "очень"). Но Вепринцев и тут оказался прав "несмотря на..." 3 апреля 2008 г. в Пущино было собрание, посвященное его памяти в связи с 80- летием. Там замечательные слова сказал седой и солидный профессор Николай Константинович Чемерис - тогда юный стройный выпускник Университета. Вот фрагменты его выступления [ 23_4 ]:

"Дорогие коллеги, в своем выступлении я попытаюсь передать свои ощущения от общения с Борисом Николаевичем. Впервые познакомился с ним около 40 лет тому назад, когда в 69 году после окончания МГУ пришел в лабораторию стажером-исследователем и Борис Николаевич бросил меня на исследования нервной клетки. Он поставил передо мной проблему: попытаться понять, каким образом внешние сигналы трансформируются во внутриклеточные процессы и последние участвуют в переработке поступающей информации. На конец 60-х и начало 70-х годов такая постановка вопроса не была общепринятой. С легкой руки Бориса Николаевича этой проблемой я занимался до конца 80-х годов, стал специалистом в этой области, защитил диссертацию и это стало поводом для попытки понять куда и как двигаться дальше. Можно было продолжать работать в направлении исследования механизмов трансформации внешних сигналов во внутриклеточные процессы и были все предпосылки для успешного продвижения в этом направлении, однако эта работа становилась, с моей точки зрения, рутинной. И в этот период переосмысления пройденного двадцатилетнего пути, как я теперь понимаю, сработала заложенная Борисом Николаевичем установка о том, что рутина необходима, но она второстепенна, первостепенной же целью должно быть решение принципиальных проблем, даже если они считаются и не разрешимыми... ...Прошло уже много лет, как с нами нет Бориса Николаевича, и только теперь мы начинаем понимать многое из того, к чему были сопричастны. Я согласен с Ольгой Дмитриевной, что мы как дети обижались на него, считали, что он разбрасывается, не доводит до конца те темы, которые он поставил, а мы в них влезли по уши и считаем их самыми важными в своей жизни. Прошли многие годы и только теперь постепенно я начинаю понимать всю масштабность тех идей, тех работ, тех заделов, которые сделал Борис Николаевич... Интрига работ в следующем. В 60-е годы благодаря работам шведского цитолога Хольгера Хидена возникло и широко распространилось представление о так называемых молекулах памяти . X. Хиден разработал метод, позволяющий анализировать количество РНК в нервных клетках теплокровных животных. В экспериментах по обучению крыс X. Хиден и его сотрудники обнаружили, что количество РНК в нейронах тех областей мозга крыс, которые предположительно имеют отношение к обучения, увеличивается. Они выдвинули гипотезу, что в ходе обучения активируются новые, ранее "молчавшие" гены, которые синтезируют новую информационную РНК, являющуюся носителем памяти - молекулами памяти.

Гипотеза красивая, однако, затем последовало множество публикаций, в которых экспериментаторы демонстрировали как активацию, так и торможение синтеза РНК. Борис Николаевич предположил, что эта неудача связана с неадекватно выбранным объектом исследования. Действительно мозг крысы является в высшей степени сложно организованной структурой, отдельные нейроны которой, в процессе обучения, могут либо "активироваться" либо "тормозиться" - отсюда вытекает и неоднозначность результатов. Возник вопрос: как обойти эту проблему? Для ее успешного решения необходимо было найти адекватный поставленной задаче, достаточно удобный упрощенный объект. У западных ученых был подходящий для этих целей объект - морской моллюск Аплизия . В мозге моллюска есть несколько гигантских нейронов тело которых больше одного миллиметра и на фоне других более мелких нейронов прекрасно видно даже при малом увеличении бинокулярного микроскопа. Каждый из гигантских нейронов строго локализован в ганглиях мозга и всегда выполняет одну и туже присущую ему функцию, какую бы Аплизию вы бы ни взяли, и связан строго определенным образом с другими нервными клетками ганглия. Всем была бы хороша Аплизия, но она водится в теплых южных морях и каждый ее экземпляр стоил несколько сот долларов.

Российским ученным такой объект был недоступен и нужно было найти подобный, но существенно более доступный объект и он был найден. Им оказался Большой прудовик , который в больших количествах живет в старицах рек, прудах и озерах. В его ганглиях, так же как и у Аплизии, были обнаружены строго локализованные гигантские нейроны, размер тела которых был чуть меньше одно миллиметра. В последующих работах были составлены карты локализации гигантских нейронов и показано, что эти нейроны строго специализированы и обладают индивидуальными выраженными характеристиками своей электрической активности и специфической чувствительности к медиаторам.

С легкой руки Бориса Николаевича и благодаря его фундаментальным работам вот уже несколько десятков лет Большой прудовик является излюбленным объектом отечественных нейрофизиологов. ...Хотелось бы подчеркнуть огромную подготовительную работу предшествующую непосредственной проверке гипотезы. Это, наверное, была одна из основных черт характера Бориса Николаевича - ставить крупную проблему, намечать четкий план для ее решения и невзирая ни на какие трудности двигаться в направлении ее решения. Для проверки гипотезы X. Хидена были выбраны два подхода. Первый был основан на электронно микроскопическом изучении динамики изменения структуры нейрона под воздействием электрической или медиаторной стимуляции активности нейрона. Второй связан с методом радиоавтографии и регистрации динамики включения меченых предшественников во вновь синтезируемые молекулы РНК. Оба эти метода дали схожие результаты. В процессе стимуляции нейрона наблюдается двухфазная динамика изменения синтетической активности нейрона. В первую фазу стимуляции происходят структурные перестройки внутри тела нейрона, направленные на снижение продукции РНК и синтеза белков. После кратковременного торможения увеличивается поверхность ядра сопровождающаяся увеличением количества рибосом в ретикулуме, что говорит о резком возрастании синтеза РНК и белков. Первая часть гипотезы X. Хидена была доказана. Изменение активности нейрона сопровождается изменением синтеза РНК и соответственно белков.

...Борис Николаевич понимал, что дальнейшее существенное продвижение в этом направлении связано с идентификацией белков, их транспортом к синапсам и целым рядом других процессов связанных со стойкими изменениями в структурах нейрона, которые связаны с процессами переработки сигналов. Для исследования всех этих проблем в начале 80-х годов еще не существовало даже принципиальных подходов. Они стали формироваться только с развитием молекулярной биологии, которая начала достигать необходимого уровня только в этом 21 веке. Все это говорит о еще одной черте характера Бориса Николаевича, а именно умение трезво оценивать возможности кардинального решения поставленных проблем.

Как мне теперь видится он с большим трудом и мучительностью отходил от проблем, которые на тот момент принципиально не могли быть решены. Для этого нужно иметь незаурядное мужество. Чего греха таить и я многие из нас иногда по инерции "ржавой лопатою мерзлую землю долбим", хотя и понимаем, что для принципиального решения проблемы время еще не подошло, можно ставить эксперименты, публиковать статьи в престижных журналах, но сделать кардинальный прорыв в выбранной области в ближайшие годы не удастся.

Вторая проблема, которой занимался Борис Николаевич, тесно связана с той, о которой я уже рассказал. Он формулировал ее так: как передается сигнал с внешней стороны мембраны нейрона внутрь клетки? Со времен Нобелевских работ Алана Ходжкина и Андру Хаксли было известно, что нервные импульсы, который осуществляют коммуникации между нервными клетками, формируются потенциал зависимыми потоками ионов натрия и калия. Однако изменение внутриклеточной концентрации этих ионов при генерации потенциала действия ничтожно, поэтому этот процесс не может быть сигнальном для управления внутриклеточными процессами. По той же причине и ионы магния не подходят для этой цели, даже если бы они и участвовали в генерации потенциала действия. Остается последний претендент - ионы кальция . Было хорошо известно, что внутриклеточная концентрация ионов кальция на три порядка меньше внеклеточной. Если бы в процессе генерации потенциала действия открывались пути поступления ионов кальция внутрь нервной клетки, то это могло бы вызвать многократное увеличение их внутриклеточной концентрации, что могло бы быть управляющим сигналом для ряда метаболических путей. Эти рассуждения поддерживались и тем, что кальций, являясь физиологически активным ионом, регулирует активность большинства известных белков. Эти предпосылки подтолкнули Бориса Николаевича предположить, что на теле нервной клетки, в процессе генерации трансмембранного потенциала действия, открываются пути поступления кальция внутрь нейрона. Проверкой этой красивой идеи он занялся вместе со своими коллегами Игорем Крастсом и Ольгой Жереловой . Объектом исследования были гигантские нейроны прудовика, о которых я рассказывал чуть раньше. В конце 60х годов еще не существовало подходов для исследования ионных токов методом фиксации потенциала на нейронах, поэтому был выбран метод исследования амплитуды "овершута" - превышения амплитуды потенциала действия над нулевым уровнем. По теории Нернста его величина пропорциональна проводимостям тех типов ионных токов, которые участвуют в формировании потенциала действия. Для проведения исследований была разработана аппаратура для обеспечения жизнедеятельности мозга моллюска, смены растворов и достаточно точного измерения амплитуды потенциала действия. Полученные результаты однозначно показывали, что в формировании потенциала действия нейрона однозначно участвуют ионы кальция и натрия. При этом на пике потенциала действия проницаемость мембраны для ионов кальция многократно превышала таковую для ионов натрия. Этот результат был принципиально новым и не укладывался в общепринятую, устоявшуюся теорию Ходжкина-Хаксли о натрий-калиевой природе потенциала действия .

Я помню конференции в Паланге по биофизике мембран , на которых горячо обсуждались эти работы и приводились самые разные доводы, почему ионы кальция не могут участвовать в формировании потенциалов действия, а его роль вторична. Действительно метод овершута - косвенный метод, а для критически настроенных ученых требовались прямые экспериментальные доказательства. И только приблизительно через десять лет с использованием метода фиксации потенциала на изолированных нейронах в Институте Физиологии им. Богомольца в Киеве П. Г. Костюку с коллегами удалось зарегистрировать и охарактеризовать кальциевые токи, которые возникают при деполяризации мембраны нервной клетки. Приоритет этих работ был зафиксирован в сертификате на открытие. Борис Николаевич умел ставить принципиальные задачи и, как оказывалось, интуиция его практически никогда не подводила и они практически всегда решались.

Для всех этих работ нужны были новые приборы и оборудование, которого в нашей стране не было. См. Микроманипуляторы. Микрохирургия клетки

Борис имел талант доверия к окружающим. Только начинался Пущинский Научный центр. Было построено лишь одно здание нашего Института биофизики. В отдельных комнатах нашего здания были "зародыши" других, будущих институтов. В августе 1965 г. Б. Н. встретился с молодым инженером Анатолием Матвеевичем Хохловым - они поняли друг друга. В недавно созданным Пущино СКБ Биологического приборостроения были квалифицированные инженеры и умелые рабочие. Они начали работу вместе с сотрудниками лаборатории Вепринцева И. Крастсом , Н. Чемерисом и еще довоенным, КЮБЗовским, другом Бориса - Грегором Куреллой . Поразительно! Уже в 1967 г. был изготовлен опытный образец микроманипулятора КМ-1 , т. е. комплект микроманипуляторов первой модели. Вепринцев был трудным "заказчиком" - он имел множество претензий. Их учли и в 1969 г. изготовили первую опытную партию из 5 штук КМ-1. Вот как об этом в 2008 г., на том же собрании, посвященном Б. Н. Вепринцеву, вспоминает А. М. Хохлов [ 23_5 ]: Это была большая победа, так как пришлось освоить ряд новых прецизионных технологий, обучить рабочих и другой технический персонал. Приборы сразу поступили исследователям, его достоинства оценили, на него появился хороший спрос. Прибор, как того хотел Борис Николаевич, был универсален, имел несколько легко сменяемых головок с различными характеристиками, легко компоновался с различными микроскопами под методику эксперимента. Он имел антивибрационное основание и не требовал в эксплуатации каких-либо дополнительных жестких столов и верстаков. Он помещался в небольшом экране для защиты объекта от электромагнитных помех. В 1972 г. прибор экспонировался на Лейпцигской ярмарке и получил Большую золотую медаль и диплом... Сам прибор и его международный успех вызвал огромный резонанс в Пущинском центре, в Академии наук, среди ученых, изучающих клетку.

Встала потребность в создании сопутствующих приборов и в дальнейшем расширении возможностей прибора. Было решено создать комплексную программу по созданию аппаратуры для клеточных исследований, и в 1973 г. такая программа была разработана и опубликована (Б. Н. Вепринцев, А. М. Хохлов и Г. Р. Иваницкий). Она была одобрена в Пущинском центре, рассмотрена и принята в Совете по научному приборостроению АН СССР ( В. Л.Тальрозе ) и в Управлении по научному приборостроению АН СССР ( А. Г. Карпенко ). Мы получили финансирование и к 1978 г. разработали всю необходимую аппаратуру для оснащения клеточной лаборатории от получения стеклянного капилляра для микроинструмента до обработки полученной информации. На выставке "СЭВ-Наука-1978" в Москве экспозиция клеточной лаборатории пользовалась огромным вниманием у наших и зарубежных исследователей. Опять успех! В 1980 г. комплекс был удостоен почетного диплома и золотой медали ВДНХ СССР. В 1980 г. было принято решение об освоении серийного производства на Экспериментальном заводе научного приборостроения в Черноголовке .

В 1982 г. была выпущена 1-ая партия серийных приборов. В 1982 г. комплекс приборов был удостоен Государственной премии СССР. В этот же период вышла статья Б. Н. Вепринцева и Н.Н. Ротт в журнале "Nature" об идее сохранения генетических ресурсов животных , находящихся на грани исчезновения, с использованием криоконсервации [ 23_2 ]. Предлагались пути для разработки методов восстановления живых особей из размороженного материала. Идея получила огромный резонанс в мире. В 2006 г. при Российской академии сельскохозяйственных наук с участием ряда институтов Российской академии наук образовано Общество сохранения генетических ресурсов им. Б. Н. Вепринцева . Б. Н. Вепринцев поставил задачу создания комплекса приборов, необходимых для разработки экспериментальных подходов и методов для реконструкции клеток и эмбрионов. Полным ходом шла подготовка создания криобанка клеток редких и исчезающих видов при ИБФ АН СССР . Вепринцевым с коллегами была создана Целевая программа эмбриогенетики, которую курировал вице-президент АН СССР академик Ю.А.Овчинников . Помимо лаборатории Б. Н. Вепринцева в ИБФ АН СССР, были привлечены кафедра Эмбриологии МГУ и Институт молекулярной генетики АН СССР ( лаборатория проф. К. Г. Газаряна ). Мы приступили к разработке прибора для микрохирургии яйцеклетки, кратко ПМЯ-1. На эту работу мы получили целевое финансирование в 1,8 млн рублей - большие деньги по тем временам. Кроме ПМЯ-1 проходила разработка приборов для культивирования клеток и органных культур. В ней использовались новые подходы - магнитные носители, пористые мембраны и диффузные подложки. Работа проводилась в сотрудничестве с д.т.н. Э. И. Лежневым . Были разработаны и изготовлены опытные образцы. ПМЯ-1 был поставлен в лабораторию Бориса Николаевича. Было принято решение изготовить опытную партию приборов ПМЯ-1 из 5 штук, которая и была изготовлена в течение года совместно с заводом в Черноголовке. Приборы были поставлены в различные организации: два в ИБФ АН СССР, один в Институт животноводства в Харькове, один в ИМГ АН СССР и один вице президенту академии академику Ю.А. Овчинникову. Большая часть приборов находится в работе до настоящего времени.

80-е годы характеризовались развитием содружества со странами СЭВ. Наша лаборатория вместе с Б. Н. Вепринцевым имели договора и финансирование на совместную разработку приборов с фирмой "Техпан", Польша. Насосами "Техпан" мы комплектовали приборы для обеспечения жизнедеятельности клеток. Совместно с Сегедским биологическим центром , Венгрия, шла разработка усилителя "pathclamp" и набора микроманипуляторов к нему. Совместно с Институтом энтомологии ЧССР шла разработка прибора для электрослияния клеток, а с фирмой "Карл Цейсе", ГДР, инвертированного микроскопа для микрохирургии клеток и эмбрионов. При этом все работы к концу 80-х годов были воплощены в опытные образцы, а также разработан новый микроманипулятор для инвертированного микроскопа. После выполнения этих работ необходимо было определить дальнейшее развитие клеточных исследований и аппаратуры для них.

Нами была разработана дальнейшая концепция развития этой темы. Статья была опубликована в 1990 г., когда Б. Н. Вепринцева не стало.

К великому горю, он скоропостижно скончался 11 апреля 1990 г. Более 60 научных учреждений АН СССР, ВАСХНИЛ, Минмедпрома и других ведомств были обеспечены нашей аппаратурой для проведения микрохирургических и микроэлектродных работ с клеткой. Был накоплен большой опыт работ, который вывел клеточные исследования на передовой уровень. Но это не было финалом. Необходимость разработки новой аппаратуры и совершенствование созданной диктовалась, прежде всего, появлением новых методов исследований, объектов иной структурной организации, необходимостью повышения точности и воспроизводимости результатов измерения; применением вычислительной и микропроцессорной техники, созданием новой элементной базы и новой технологии, а также необходимостью учета требований быстро развивающейся биотехнологии, внедрения ряда методов и технических средств в сферу материального производства (скрининг и проверка на биологическую активность новых биохимических и лекарственных препаратов, перенос генетического материала и получение клеток с заданными свойствами, сохранение генетических ресурсов, культивирование биологических объектов и некоторые другие. К сожалению, осуществление этой программы сильно затянулось по нескольким причинам. Главная из них - с нами не было больше Бориса Николаевича. Кроме того, разделение Института биофизики на два института привело к разделу и лаборатории Вепринцева, что не способствовало кооперированию, и, наконец, перестройка Академии наук , казалось, предала забвению научное приборостроение . Но вот в 1994 г.

СКБ БП преобразуется в Институт биологического приборостроения РАН . Восстанавливается сотрудничество с "дочерними клетками" Института биологической физики АН СССР - Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН (в настоящее время директор - чл.-корр. Г. Р. Иваницкий ) и Институтом биофизики клетки РАН (директор - чл.- корр. Е. Е. Фесенко ), чл.-корр. Л. М. Чайлахяном , который руководит теперь бывшей лабораторией Б. Н. Вепринцева.

Выравнивается положение нашей лаборатории. С помощью гранта Миннауки мы разработали ряд недостающих приборов для полного цикла клеточных технологий - от изготовления микроинструментов из стекла до криоконсервации биологического материала. Разработаны усовершенствованный генератор для электростимулируемого слияния клеток, электропоратор, микроманипулятор с возможностью управления от ПЭВМ и другие приборы. Как предвидел и планировал Борис Николаевич, наши приборы востребованы и наукой, и практикой, заказы поступают ежегодно.

Вот один пример. Пятнадцать лет тому назад был создан медицинский центр "Эмбрион" (руководитель - к. м. н. К. Н. Кечиян ) для оказания помощи при бесплодии . Проблема серьезнейшая - по статистике в России каждая четвертая пара бесплодна. Поддерживая теснейшие связи с кафедрой Эмбриологии МГУ, вовлеченной Вепринцевым в программу по эмбриогенетике, сотрудники "Эмбриона" развивают методы экстракорпорального оплодотворения. Мы, в свою очередь, полностью оборудовали "Эмбрион" нашей микроманипуляционной аппаратурой и помогаем в обслуживании приборов. Центр эффективно работает, за это время проведено около 3500 успешных операций. Действительно, предвидения Б. Н. Вепринцева сейчас сбываются - клеточные технологии вышли на широкую дорогу в сельском хозяйстве и медицине. Клонирование и заместительная клеточная терапия - не только сюжет в средствах массовой информации, но предмет серьезного обсуждения научной общественностью.

Ссылки:
1. Вепринцев Б. Н. на Биофаке МГУ, 1945-1948 гг.
2. Вепринцев Б. начал проект "Криобанк"
3. Вепринцев Б.Н., нервные клетки, голоса птиц и "Криобанк"
4. Социализм

 

 

Оставить комментарий:
Представьтесь:             E-mail:  
Ваш комментарий:
Защита от спама - введите день недели (1-7):

Рейтинг@Mail.ru

 

 

 

 

 

 

 

 

Информационная поддержка: ООО «Лайт Телеком»